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使用凯氏定氮法测定蜂王浆粗蛋白


1.原理     
  以浓硫酸消化分解蛋白质,其中的氮变成氨,再与硫酸化合生成硫酸铵。生成的硫酸铵与氢氧化钠反应再生成氨,用蒸馏法使氨蒸出,用标准浓度的硫酸溶液与其反应,剩余的硫酸再经氢氧化钠标准溶液滴定,从实际消耗的酸量可推算出生成的氨量。 
2.仪器与试剂 
(1)仪器:分析天平(0.000 lg)、50ml凯氏烧瓶、凯氏定氮半微量蒸馏装置1套、滴定装置1套。 
(2)试剂: 浓硫酸(分析纯,密度1.84)。 
硫酸铜与硫酸钾混合试剂:称取5水硫酸铜1g、硫酸钾10g,置于研钵中混合均匀,研细备用。 
混合指示剂:量取0.1%次甲基红乙醇溶液2份和0.1%溴甲酚绿乙醇溶液3份,临用时混合。 
2%硼酸溶液:称取硼酸2g,量取混合指示剂2ml、乙醇20ml,置于锥形瓶中,加蒸馏水溶解并稀释至100ml,摇匀备用。 
40%氢氧化钠溶液:称取氢氧化钠40g,加蒸馏水溶解并稀释至100ml。

稀硫酸:量取浓硫酸5.7ml,加蒸馏水稀释至100ml。 
0.01 mol/L的标准酸溶液
3.测定方法 
(1)消化:准确称取蜂王浆样品约1g,放入干燥的凯氏烧瓶内,加入2g硫酸铜与硫酸钾混合试剂,再沿瓶壁缓缓加入61ml浓硫酸,在瓶口放一小漏斗,使烧瓶成45°斜放,在通风橱内置于电炉上加热消化(先小火缓缓加热,使溶液温度保持在沸点以下,等暴沸停止后,逐步加大火力)。待消化液呈清澈的亮绿色后,再继续加热30min,消化即可完毕(消化时间约为lh),冷却后备用。 
(2)蒸馏:量取2%硼酸溶液10ml置于100ml的锥形瓶中,加入混合指示剂2滴和少量稀硫酸,将冷凝管尖端浸入液面下。然后,将凯氏烧瓶中的消化液经由漏斗移人蒸馏器中,用少量蒸馏水淋洗凯氏烧瓶和玻璃漏斗数次。向蒸馏器中加入40%氢氧化钠溶液约25ml之后,再加入5ml蒸馏水(一半流入蒸馏器,一半在玻璃杯中作水封)。用调温电炉加热开始蒸馏。待锥形瓶内溶液的颜色由酒红色变为蓝绿色时,继续蒸馏10min,将冷凝管尖端提出液面,使蒸汽继续冲洗1 min,用少量蒸馏水淋洗尖端,停止蒸馏。 
(3)滴定:用0.01 mol/L的标准酸溶液滴定锥形瓶中吸收的氨量,滴定至溶液由蓝绿色变为灰紫红色为终点,并作空白试验校正。 
4.计算       

图片1.png 

式中:

      V1——样品消耗标准酸溶液的体积,mL

      V2——空白消耗标准酸溶液的体积,mL

      N——标准酸溶液标定的当量浓度,mol/L

      0.014——1N标准酸溶液1mL相当于氮克数;

      F——蛋白质系数,蛋白制品为6.25

      m——样品的质量,g

      D——样品的稀释倍数

平行实验允许误差不超过±2%,取平均值确定结果。
鉴于手工操作比较繁琐,推荐使用北京优谱通用科技有限公司的1800系列全自动凯氏定氮仪进行测定,全自动操作,加酸,加碱、蒸馏、滴定、结果计算和打印输出全自动完成,无需人工干预!

 


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